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ELISA 检测样品的处理方法

发布时间:2018-09-18 15:46 |  点击次数:

首先应保证样本不含 NaN3(叠氮钠),因为 NaN3 会抑制 HRP 的活性,从而导致假阴性的结果。

一、ELISA 血清样本处理及保存步骤
用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本,将试管或离心管室温放置 2 小时或 4℃ 过夜,使血清析出。4℃ 3000rpm 离心 5~-10 分钟,仔细收集上清。建议将血清分装多份,-20℃ 或-80℃ 保存,避免反复冻融。
采血过程中应避免溶血,因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质,在以 HRP 为标记的 ELISA 检测中会有非特异性的显色,而导致检测的不准确性。

二、ELISA 血浆样本处理及保存步骤
用含抗凝剂的采血管或离心管(EDTA、肝素钠和枸橼酸钠)采集血液标本,标本采集后 60 min 内 4℃ 3000rpm 离心 5~10 分钟,取上清即血浆。将上清分装多份,-20℃ 或-80℃ 保存,避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。

三、ELISA 细胞培养上清样本处理及保存步骤
取细胞培养上清到离心管,3000rpm 离心 5~10 分钟,除去细胞碎片及杂质,取上清,-20℃ 或-80℃ 保存,避免反复冻融。

四、ELISA 细胞裂解液样本处理及保存步骤
1. 吸去培养板内的培养基,用胰酶消化细胞,加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。
2. 收集细胞悬液,3000rpm 离心 5~10 分钟,弃去培养基,用预冷的 PBS 润洗 3 次。
3. 加入适量的预冷 PBS 重悬细胞。通常 6 孔板一个孔的细胞量需要 150~250μL PBS 重悬。
4. 将样品放入液氮中或-80℃ 冰箱,使样品冷冻,再放室温解冻样品,反复冻融几次,使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎,以达到裂解的目的。
5.3000rpm 离心 5-10 分钟,除去细胞碎片,取上清,-20℃ 或-80℃ 保存,避免反复冻融。

五、ELISA 组织匀浆液样本处理及保存步骤
1. 将组织样本用 PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗,洗去组织表面残留的血液或杂质。
2. 将组织块称重,记录后剪碎,碎块应尽量小,便于匀浆得更充分
3. 将组织按一定的比例加入预冷的 PBS(临用前加入蛋白酶抑制剂)匀浆,匀浆时置于冰上或冰浴中。(通常按组织重量:PBS 体积=1:9 的比例匀浆,例如 1 g 的组织样本对应 9 mL 的 PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数)
4. 吸取匀浆液到离心管,4℃ 10000rpm 离心 5~10 min,取上清,-20℃ 或-80℃ 保存,避免反复冻融。

六、ELISA 尿液、唾液、胸腹水、脑脊液等其他体液样本
用干净容器收集尿液/唾液/胸腹水,4℃、3000 rpm/min 离心 5~10 min,收集上清。置于-20℃(1-2 周)或-80℃ 保存(较长时间),避免反复冻融。
总的来说,因为 ELISA 只能检测可溶性蛋白的含量,所以应保证所有样本均为澄清的液体,沉淀或悬浮物都应离心去除。

七、ELISA 粪便标本收集、处理、保存方法
采集时用干净的竹签挑取粪便样本到离心管中,向离心管中加入适量 PBS 缓冲液(0.01M,PH 7.4),搅拌均匀(通常按粪便重量:PBS 体积=1:9 的比例匀浆,例如 1 g 的粪便样本对应 9 ml 的 PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数)。然后 4℃、10000 rpm/min 离心 10 min,小心收集上清。置于-20℃ 或-80℃ 保存,避免反复冻融。
为了保证检测的准确性,保存于-20℃ 的样本最好在 1~6 个月内检测;保存于-80℃ 的样本最好在一年内检测;4℃ 保存的样本应在 1 周内进行检测。

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