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齐一生物科技（上海）有限公司
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公司新闻/正文
细胞培养的应用
996 人阅读发布时间：2014-09-09 09:15
摘要: 细胞培养是生物医学中的一项重要技术，本文简介其在细胞生物学、生物化学、临床检验学等领域的应用。
1细胞培养
细胞培养是生物医学中的一项重要技术，应用较为广泛，渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等各个领域。
1.1细胞的来源
可直接来自人或动物组织，也可间接来自于细胞系。前者直接来自生物体，各项生物指标更接近于在体情况；但一般细胞的提取过程较繁冗，而且大多数细胞只能原代培养或只能传1~2代，如人血管内皮细胞、小鼠神经细胞等；细胞系的好处是较为方便，可直接购买使用，免去了分离过程，一般可较稳定地传代，但其生物学指标与在体情况有一定差异。
1.2细胞培养的实验室要求
细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min，然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。
2以人血管内皮细胞为例说明细胞培养
由于细胞本身性质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉
（来自于产后24h以内），具体的分离方法是：取新生儿脐带血(25 cm左右)，放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4°C保存，24h内进行实验。
2.1.取材和原代培养
在脐静脉的两端各插入一支磨平的注射器针头，用止血钳夹住脐带以防针头滑出，用注射器从异端的针头注入PBS冲洗血管，直到流出PBS无明显血迹，用PBS将残留血液冲洗干净，以充分暴露内皮细胞。注入0.1%(g/L)胶原酶溶液(用PBS配制)，待血管内残留PBS流尽后，用注射器封住另一端针头，继续注入胶原酶，充盈血管，于室温下消化20-30min，掌握好消化时间，否则，时间太短会致消化不完全，造成浪费；时间太长，可能会将平滑肌细胞一并消化下来，造成生物污染，干扰内皮细胞的生长。将消化液打入无菌的离心管中，离心(800r/min, 8min)。轻轻吸出上清液，加5mL培养液于离心管中悬浮细胞。加2mL纤粘连蛋白（1mg/mL）于培养瓶中，铺均匀后，吸出剩余液体，放置片刻，将细胞种入培养瓶，置CO2孵育箱培养，24h后换液一次，以后每48h换液一次，4-6天汇合成内皮单层。消化时间要掌握好，若时间太短会致消化不完全，造成浪费；时间太长，又会将平滑肌细胞一并消化下来，造成生物污染，干扰内皮细胞的生长。
2.2.传代
当培养瓶内内皮细胞形成致密单层时，进行传代。PBS冲洗细胞2次，加0.125%(g/L)胰蛋白酶/0.02%(g/L)EDTA·Na2 1mL消化细胞，显微镜下可观察到细胞立即收缩、变圆，当观察到大部分细胞脱落时即可加入培养液，以终止胰酶的作用，用滴管吹打壁上的细胞使其脱落及分离，离心(800r/min,5min)，加入培养液，按1:2比例接种于培养瓶中。
2.3冻存
内皮细胞生长到一定数量时，暂时不用的细胞，要将其冻存于液氮内备用，即：将胰蛋白酶消化下来的细胞，加入少量培养液后，离心(800r/min,5min)，弃上清液，加入细胞冻存液(含10%[体积分数]二甲基亚砜培养液)，将细胞密度调至106细胞/mL，置于细胞冻存管中，每管1mL，塞入泡沫塑料盒内(以放慢降温速度)，放入-70°C冰箱过夜，第2天迅速转入液氮中储存。待使用时再将冻存的细胞复苏。复苏时，迅速投入37°C水浴中并不断振摇，使之迅速融化，离心(800r/min,5min)，弃上清液，以去除二甲基亚砜。加入适量培养液，并在培养瓶中培养。冻存和复苏，简单概括就是要慢冻速融。
2.4其他
根据要研究的对象和目的的不同以及解决问题的角度不同，来确定要培养哪种细胞。如，要研究动脉硬化的血管相关问题，一般要培养血管内皮细胞；而要研究有关老年痴呆的问题，则一般要培养神经细胞进一步加以研究。
确定要培养哪种细胞，后要考虑通过细胞哪些性质或特点来进行研究。大体上可以根据细胞表面标志或分泌功能来选定研究方法。利用细胞表面标志，可采用细胞免疫化学、免疫荧光等方法；利用细胞分泌功能，可以采用ELISPOT等方法。
3细胞培养的应用
3.1分子生物学研究
不同生物体表达某种物质会有差异，不同细胞也会存在着这种表达上的差异。这种差异到底是来自于基因水平还是直接来自于蛋白水平？可以通过反转录PCR（RT-PCR）的方法进一步研究。首先，细胞培养得到足够数量的细胞，将这些细胞的总RNA提取出来，再反转录为cDNA，通过PCR以后，可以将基因水平的差异放大，从而可以明确表达上的差异来自于基因mRNA（转录水平）还是来自于蛋白（翻译水平）。如本实验室研究的糖皮质受体（GR）的表达差异即是存在于转录水平。
3.2用于基因治疗
细胞培养在基因治疗方面也有很大作用。本实验室利用
培养的SY5Y细胞，通过将早老素基因PS-1转染入SY5Y细胞；而后，用RT-PCR证明转染有PS-1基因的细胞内部有PS-1 mRNA转录，用单抗检测细胞PS-1蛋白的表达。而后可用以检测细胞是否有早老现象。再用类似方法，我们可以研究细胞的钙通道以及其它药物作用的膜通道，从而指导临床药物应用，并据此来研究新的药物。
参考文献：
[[1]] Maciag T, Hoover GA, Stemerman MB, SeriaL Propagation of Human EndotheLiaL CeLLs In vitro. J CeLL BioLogy, 1981,91, 420-426.
[[2]]张星虎,许贤豪,王红,等.重症肌无力患者对糖皮质激素的敏感性和糖皮质激素受体的关系. 中国神经免疫及神经病学杂志,2000,7(4):204-208.
1细胞培养
细胞培养是生物医学中的一项重要技术，应用较为广泛，渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等各个领域。
1.1细胞的来源
可直接来自人或动物组织，也可间接来自于细胞系。前者直接来自生物体，各项生物指标更接近于在体情况；但一般细胞的提取过程较繁冗，而且大多数细胞只能原代培养或只能传1~2代，如人血管内皮细胞、小鼠神经细胞等；细胞系的好处是较为方便，可直接购买使用，免去了分离过程，一般可较稳定地传代，但其生物学指标与在体情况有一定差异。
1.2细胞培养的实验室要求
细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min，然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。
2以人血管内皮细胞为例说明细胞培养
由于细胞本身性质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉
（来自于产后24h以内），具体的分离方法是：取新生儿脐带血(25 cm左右)，放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4°C保存，24h内进行实验。
2.1.取材和原代培养
在脐静脉的两端各插入一支磨平的注射器针头，用止血钳夹住脐带以防针头滑出，用注射器从异端的针头注入PBS冲洗血管，直到流出PBS无明显血迹，用PBS将残留血液冲洗干净，以充分暴露内皮细胞。注入0.1%(g/L)胶原酶溶液(用PBS配制)，待血管内残留PBS流尽后，用注射器封住另一端针头，继续注入胶原酶，充盈血管，于室温下消化20-30min，掌握好消化时间，否则，时间太短会致消化不完全，造成浪费；时间太长，可能会将平滑肌细胞一并消化下来，造成生物污染，干扰内皮细胞的生长。将消化液打入无菌的离心管中，离心(800r/min, 8min)。轻轻吸出上清液，加5mL培养液于离心管中悬浮细胞。加2mL纤粘连蛋白（1mg/mL）于培养瓶中，铺均匀后，吸出剩余液体，放置片刻，将细胞种入培养瓶，置CO2孵育箱培养，24h后换液一次，以后每48h换液一次，4-6天汇合成内皮单层。消化时间要掌握好，若时间太短会致消化不完全，造成浪费；时间太长，又会将平滑肌细胞一并消化下来，造成生物污染，干扰内皮细胞的生长。
2.2.传代
当培养瓶内内皮细胞形成致密单层时，进行传代。PBS冲洗细胞2次，加0.125%(g/L)胰蛋白酶/0.02%(g/L)EDTA·Na2 1mL消化细胞，显微镜下可观察到细胞立即收缩、变圆，当观察到大部分细胞脱落时即可加入培养液，以终止胰酶的作用，用滴管吹打壁上的细胞使其脱落及分离，离心(800r/min,5min)，加入培养液，按1:2比例接种于培养瓶中。
2.3冻存
内皮细胞生长到一定数量时，暂时不用的细胞，要将其冻存于液氮内备用，即：将胰蛋白酶消化下来的细胞，加入少量培养液后，离心(800r/min,5min)，弃上清液，加入细胞冻存液(含10%[体积分数]二甲基亚砜培养液)，将细胞密度调至106细胞/mL，置于细胞冻存管中，每管1mL，塞入泡沫塑料盒内(以放慢降温速度)，放入-70°C冰箱过夜，第2天迅速转入液氮中储存。待使用时再将冻存的细胞复苏。复苏时，迅速投入37°C水浴中并不断振摇，使之迅速融化，离心(800r/min,5min)，弃上清液，以去除二甲基亚砜。加入适量培养液，并在培养瓶中培养。冻存和复苏，简单概括就是要慢冻速融。
2.4其他
根据要研究的对象和目的的不同以及解决问题的角度不同，来确定要培养哪种细胞。如，要研究动脉硬化的血管相关问题，一般要培养血管内皮细胞；而要研究有关老年痴呆的问题，则一般要培养神经细胞进一步加以研究。
确定要培养哪种细胞，后要考虑通过细胞哪些性质或特点来进行研究。大体上可以根据细胞表面标志或分泌功能来选定研究方法。利用细胞表面标志，可采用细胞免疫化学、免疫荧光等方法；利用细胞分泌功能，可以采用ELISPOT等方法。
3细胞培养的应用
3.1分子生物学研究
不同生物体表达某种物质会有差异，不同细胞也会存在着这种表达上的差异。这种差异到底是来自于基因水平还是直接来自于蛋白水平？可以通过反转录PCR（RT-PCR）的方法进一步研究。首先，细胞培养得到足够数量的细胞，将这些细胞的总RNA提取出来，再反转录为cDNA，通过PCR以后，可以将基因水平的差异放大，从而可以明确表达上的差异来自于基因mRNA（转录水平）还是来自于蛋白（翻译水平）。如本实验室研究的糖皮质受体（GR）的表达差异即是存在于转录水平。
3.2用于基因治疗
细胞培养在基因治疗方面也有很大作用。本实验室利用
培养的SY5Y细胞，通过将早老素基因PS-1转染入SY5Y细胞；而后，用RT-PCR证明转染有PS-1基因的细胞内部有PS-1 mRNA转录，用单抗检测细胞PS-1蛋白的表达。而后可用以检测细胞是否有早老现象。再用类似方法，我们可以研究细胞的钙通道以及其它药物作用的膜通道，从而指导临床药物应用，并据此来研究新的药物。
参考文献：
[[1]] Maciag T, Hoover GA, Stemerman MB, SeriaL Propagation of Human EndotheLiaL CeLLs In vitro. J CeLL BioLogy, 1981,91, 420-426.
[[2]]张星虎,许贤豪,王红,等.重症肌无力患者对糖皮质激素的敏感性和糖皮质激素受体的关系. 中国神经免疫及神经病学杂志,2000,7(4):204-208.